|
پایان نامه کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی و زیست شناسی با عنوان کوآنزیم
ایزوپرنوئیدها از بزرگترین ترکیبات آلی در طبیعت بوده که دارای نقشهای گوناگون بیولوژیکی در بدن موجودات زنده از جمله انسان می باشند، از اینرو این ترکیبات از اهمیت بسیار بالایی از نظر پزشکی و غذایی و حتی دارویی برخوردار هستند از جمله مهمترین این ترکیبات می توان به یوبی کینونها اشاره نمود که هنگام تنفس سلولی در زنجیره انتقال الکترون دارای نقش بسیار مهم
|
|
| دسته بندی | کارشناسی ارشد |
| فرمت فایل | doc |
| حجم فایل | 6779 کیلو بایت |
| تعداد صفحات فایل | 166 |
پایان نامه کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی و زیست شناسی با عنوان کوآنزیم
چکیده:
ایزوپرنوئیدها
از بزرگترین ترکیبات آلی در طبیعت بوده که دارای نقشهای گوناگون بیولوژیکی
در بدن موجودات زنده از جمله انسان می باشند، از اینرو این ترکیبات از
اهمیت بسیار بالایی از نظر پزشکی و غذایی و حتی دارویی برخوردار هستند. از
جمله مهمترین این ترکیبات می توان به یوبی کینونها اشاره نمود که هنگام
تنفس سلولی در زنجیره انتقال الکترون دارای نقش بسیار مهمی می باشند. این
ترکیبات هموپلیمرهایی از واحدهای ایزوپرنی به نام ایزوپنتیل پیرو فسفات
(IPP) با ویژگی های ساختاری و فیزیکوشیمیایی مختلف هستند.
دو
آنزیم "فارنزیل دی فسفات سنتاز" و "ژرانیل ژرانیل دی فسفات سنتاز" مسئول
بیوسنتز دو ترکیب "فارنزیل دی فسفات" و "ژرانیل ژرانیل دی فسفات" که به
ترتیب هر کدام از 3 و 4 واحد ایزوپرنی تشکیل شده اند. این ترکیبات می
توانند به عنوان سوبسترا جهت سنتز دیگر ترکیبات ایزوپرنوئیدی و از جمله
کوآنزیم Q10 مورد استفاده قرار گیرند.در این مطالعه، تاثیر بیان ژنهای کد
کنندهء آنزیم "ژرانیل ژرانیل دی فسفات سنتاز" به تنهایی و یا همراه با
دیگرآنزیمهای مسیر بیوسنتز لیکوپن بر روی آنزیم "دکاپرنیل دی فسفات سنتاز" (
آنزیم مسئول ساخت زنجیرهء ایزوپرنوئید کوآنزیم Q10 ) و در نهایت تولید
کوآنزیم Q10 در سویه های نوترکیب باکتری "اشرشیاکلی " مطالعه می گردد.
کلمات کلیدی:
Coenzyme
کوآنزیم
ایزوپرنوئیدها
ترکیبات آلی
دکاپرنیل دی فسفات سنتاز
آگروباکتریوم تومی فاسینس
ردوباکتر اسفروئیدس
مواد و روشها:
در
این پژوهش ژنهای هترولوگوس کد کننده آنزیم "دکاپرنیل دی فسفات سنتاز"
(dds) از دو گونهء باکتریایی "آگروباکتریوم تومی فاسینس" (atdds) و
"ردوباکتر اسفروئیدس" (rsdds) استخراج شده و بوسیلهء دو پلاسمید جداگانه به
درون باکتری اشرشیاکلی سویه DH5α کلون گردیدند که نتیجهء آن ایجاد توانایی
تولید کوآنزیم Q10 در این باکتری بود. در ادامه میزان تولید این ترکیب در
سلولهای نو ترکیب حاصله با دستگاه HPLC مورد ارزیابی قرار گرفت.
به
منظور مطالعه اثر آنزیم "ژرانیل ژرانیل دی فسفات سنتاز" به تنهایی و یا
همراه با دیگر آنزیمهای مسیر بیوسنتز لیکوپن بر روی تولید کوآنزیم Q10
نیز؛ ژنهای مربوطه ( crtE, crtB, crtI ) از باکتری "اروینیا هربیکولا"
استخراج شده و بوسیله پلاسمیدهای جداگانه به درون سلولهای نوترکیب
اشرشیاکلی تولید کنندهء کوآنزیم Q10 کلون گردیدند. سلولهای نوترکیب حاصله
در محیط کشت "2YTG" در دمای 30 درجه سانتی گراد کشت داده شدند و سپس تولید
کوآنزیم Q10 در هر سلول مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج:
بیان
دو ژن atdds و rsdds در باکتری اشرشیاکلی با شناسایی پیک کوآنزیم Q10 توسط
دستگاه HPLC مورد تائید قرار گرفت. بطور کلی برای شناسایی و اندازه گیری
کوآنزیم Q ها از یک شناساگر اشعهء UV در طول موج 275 نانومتر استفاده می
شود.به منظور اندازه گیری غلظت کوآنزیم Q10 تولید شده در سلولهای نوترکیب
نیز از منحنی استاندارد کوآنزیم Q10 استفاده گردید.نتایج بدست آمده نشان
داد که بیان ژن کدکنندهء آنزیم "ژرانیل ژرانیل دی فسفات سنتاز" به تنهایی
در باکتری نوترکیب اشرشیاکلی که حاوی یکی از دو ژن atdds و یا rsdds می
باشد ، افزایش چشمگیری در میزان تولید کوآنزیم Q10 ایجاد نمی نماید و حتی
در بعضی موارد منجر به کاهش تولید نیز می گردد.
از
طرف دیگر بیان ژن کدکننده آنزیم "ژرانیل ژرانیل دی فسفات سنتاز" همراه با
بیان ژهای کدکنندهء آنزیم های "فیتوئن سنتاز" و "فیتوئن دساتوراز" ، که
همگی در مسیر بیوسنتز لیکوپن وجود دارند، منجر به مشاهدهء نتایج متفاوتی در
میزان تولید کوآنزیم Q10 در سلولهای نوترکیب حاوی atdds و یا rsdds شده
است. بطوریکه بیان ژنهای کدکنندهء مسیر بیوسنتز لیکوپن زمانی که با ژن
atdds همراه هستند، اثر قابل توجهی در میزان تولید کوآنزیم Q10 نمی گذارند،
در حالیکه وقتی این ژنها با ژن rsdds همراه می شوند منجر به افزایش
چشمگیری در تولید این ترکیب می گردند.
فهرست مطالب
چکیده
فصل اول (کلیات) 1
1.مقدمه : 2
2.تاریخچه کوآنزیم Q10: 3
3.بررسی ساختمان کوآنزیم Q: 3
4. بررسی واکنشهای اکسیداسیون و احیاء در کوآنزیم Q10 : 5
5.مسیر بیوسنتز" کوآنزیم Q10 : 7
5-1 مسیر سنتز زنجیرهء ایزوپرنوئیدی: 10
5-2 ساخت حلقهء یوبی کینونی: 11
5-3 اتصال حلقه به زنجیرهء ایزوپرنوئیدی و تغییرات بعدی آن: 11
6.بررسی آنزیم های کلیدی در مسیر سنتز کوآنزیمQ10 : 15
7. تاثیر مسیر بیوسنتز ایزوپرنوِِئیدها برروی تولید یوبی کینون ها: 22
7-1 مسیر بیوسنتز لیکوپن: 23
8.نقص کوآنزیم Q10 : 26
9.نقش کوآنزیم Q10 : 27
10 اثرات داروهای استاتینی بر روی بیوسنتز کوآنزیم Q10: 37
11 اهداف پژوهش : 40
12. استراتژی پژوهش : 41
13. نکات مهم پژوهش : 49
فصل دوم (مواد و روشها) 51
◙ مواد مورد استفاده در این پژوهش: 52
1 اسامی ژن های مورد استفاده: 52
اسامی پلاسمید های مورد استفاده: 52
3 آنزیم های مورد استفاده: 53
4 دستگاههای مورد استفاده در این پژوهش: 53
5 کیت های مورد استفاده در این پژوهش: 56
6 مواد ومحلول های مورد استفاده در این پژوهش : 57
◙ روش ها: 60
1. تهیه انواع محیط کشت: 60
2. استفاده از انواع آنتی بیوتیک ها در محیط های کشت : 63
3. تهیه سلول مستعد: 64
4. انتقال ژن خارجی به سلول های مستعد : 67
5. تکنیک PCR: 69
6 الکتروفورز با ژل آگارز : 73
7. خالص سازی ژن از ژل آگارز : 79
8 استفاده از آنزیم های برش دهنده: 81
9. خالص سازی نمونه DNA از آنزیم های موجود در محیط واکنش: 84
10 استخراج پلاسمید : 85
11. استخراج کوآنزیم Qاز باکتری تولید کننده: 88
12. محاسبه وزن خشک سلول : 91
13. دستگاه "pH متر": 92
14. دستگاه "اسپکتروفتومتر" : 93
.15. دستگاه تبخیر کننده: 94
16 کروماتوگرافی "HPLC": 94
فصل سوم (نتایج) 98
1.ساخت پلاسمیدهای نوترکیب: 99
1-1. ساخت پلاسمید "pDcrtE" 99
1-2. ساخت پلاسمید "pTcrtE" : 107
1-3. ساخت پلاسمید "pTlycm3" 110
1-4.ساخت پلاسمید "pBrsdds" : 118
1-5. تکثیر پلاسمید "pBatdds" 126
2. ساخت سلولها: 127
2-1 ساخت سلول E.coli-Ba: 128
2-2 ساخت سلول E.coli-Br: 129
2-3 ساخت سلول E.coli-BaDc: 129
2-4. ساخت سلول E.coli-BrDc: 129
2-5. ساخت سلول E.coli-BaTc: 129
2-6. ساخت سلول E.coli-BrTc: 130
2-7. ساخت سلول E.coli-BaTl: 130
2-8. ساخت سلول E.coli-BrTl: 130
3 اندازه گیری کوآنزیمQ10 سنتز شده در سلولهای نوترکیب: 130
3-1 انتقال سلول ها به محیط کشت : 131
3-2 استخراج کوآنزیم Qسنتز شده از سلول های نوترکیب: 133
3-3 اندازه گیری کوآنزیم Q با روش کروماتوگرافی "HPLC" : 133
4.نتایج و یافته ها : 141
5 بحث و بررسی : 146
6. پیشنهادات: 150
فصل چهارم (منابع) 151
منابع انگلیسی : 152
منابع فارسی: 162
فهرست تصاویر
فصل اول
تصویر شماره 1-1 شمای ساختار انواع کوآنزیم Q ...................................................................3
تصویر شماره 1-2 شمای ساختار کوآنزیم Q3 .........................................................................4
تصویر شماره 1-3 شمای ساختار سمی کینون ..........................................................................5
تصویر شماره 1-4 شمای ساختار یوبی کینول ..........................................................................5
تصویر شماره 1-5 سیکل کوآنزیم Q ......................................................................................6
تصویر شماره 1-6 شمای مسیر موالونات و غیر موالونات تا سنتز کوآنزیم Q10...............................9
تصویر شماره 1-7 شمای ساخت حلقه یوبی کینونی ....................................................................11
تصویر شماره 1-8 مسیر سنتز کوآنزیم Q10 ...........................................................................12
تصویر شماره 1-9 مراحل بیوسنتز کوآنزیم Q در باکتری "اشرشیاکلی" و مخمر "ساکارومایسس سرویزیه".....13
تصویر شماره 1-10 مسیر بیوسنتز لیکوپن...............................................................................25
تصویر شماره 1-11 زنجیره انتقال الکترون در یوکاریوتها...........................................................29
تصویر شماره 1-12 شمای نقش کوآنزیم Q10 در شکل گیری باند دی سولفیدی ................................30
تصویر شماره 1-13 شمای نقش کوآنزیم Q10 به عنوان عامل اکسید کننده سولفید..............................31
تصویر شماره 1-14 شمای ارتباط مسیر سنتز کوآنزیم Q با مسیر سنتز کلسترول..............................38
تصویر شماره 1-15 شمای پلاسمید pBBR1MCS2................................................................43
تصویر شماره 1-16 شمای پلاسمید pBAD24 ........................................................................44
تصویر شماره 1-17 شمای عملکرد پروموتور آرابینوز در وکتور pBAD24...................................46
تصویر شماره 1-18 شمای پلاسمید pTrc99A .......................................................................46
فصل دوم
تصویر شماره 2-1 تصویر محیط کشت جامد موجود در plate ....................................................60
تصویر شماره 2-2 دستگاه PCR .........................................................................................69
تصویر شماره 2-3 دستگاه الکتروفورز ..................................................................................73
تصویر شماره 2-4 دستگاه pH متر........................................................................................92
تصویر شماره 2-5 دستگاه اسپکتروفتومتر................................................................................93
تصویر شماره 2-6 دستگاه تبخیر کننده ...................................................................................94
تصویر شماره 2-7 دستگاه HPLC .......................................................................................95
فصل سوم
تصویر شماره 3-1 توالی ژن crtE ......................................................................................100
تصویر شماره 3-2 شمای مراحل ساخت پلاسمید pDcrtE .........................................................101
تصویر شماره 3-3 نمای الکتروفورز ژل آگارز پلاسمید pBAD24 ..............................................101
تصویر شماره 3-4 شمای دو پرایمر برگشتی و پیشرونده برای تکثیر ژن crtE ................................103
تصویر شماره 3-5 نمای الکتروفورز ژل آگارز ژن crtE ..........................................................103
تصویر شماره 3-6 پلاسمید خطی شده pBAD24 .....................................................................104
تصویر شماره 3-7 نمای الکتروفورز ژل آگارز آماده سازی ژن و پلاسیمد برای ساخت پلاسمید pDcrtE ......105
تصویر شماره 3-8 شمای پلاسمید pDcrtE ............................................................................106
تصویر شماره 3-9 نمای الکتروفورز ژل آگارز کنترل پلاسمید pDcrtE........................................106
تصویر شماره 3-10 شمای مراحل ساخت پلاسمید pTcrtE .......................................................107
تصویر شماره 3-11 نمای الکتروفورز ژل آگارز پلاسمید pTrc99A ...........................................107
تصویر شماره 3-12 نمای الکتروفورز ژل آگارز پلاسمید خطی شده pTrc99A ..............................108
تصویر شماره 3-13 نمای الکتروفورز ژل آگارز آماده سازی ژن و پلاسیمد برای ساخت پلاسمید pTcrtE .....109
تصویر شماره 3-14 شمای پلاسمید pTcrtE ..........................................................................109
تصویر شماره 3-15 نمای الکتروفورز ژل آگارز کنترل پلاسمید pTcrtE ......................................110
تصویر شماره 3-16 توالی ژن crtB ....................................................................................111
تصویر شماره 3-17 توالی ژن crtI ...........................................................................112 و 113
تصویر شماره 3-18 شمای مراحل ساخت پلاسمید pTlycm3 .....................................................113
تصویر شماره 3-19 نمای الکتروفورز ژل آگارز پلاسمید pTlycm4 ............................................114
تصویر شماره 3-20 نمای الکتروفورز ژل آگارز 3 ژن موجود در پلاسمید pTlycm4 ......................115
تصویر شماره 3-21 نمای الکتروفورز ژل آگارز 3 ژن جدا شده از پلاسمید pTlycm4 .....................115
تصویر شماره 3-22 نمای الکتروفورز ژل آگارز آماده سازی ژن و پلاسیمد برای ساخت پلاسمید pTlycm4...116
تصویر شماره 3-23 نمای الکتروفورز ژل آگارز پلاسمید خطی شده pTrc99A پس از خالص سازی ...117
تصویر شماره 3-24 شمای پلاسمید pTlycm3 .......................................................................117
تصویر شماره 3-25 نمای الکتروفورز ژل آگارز کنترل پلاسمید pTlycm3 ...................................118
تصویر شماره 3-26 توالی ژن rsdds ..................................................................................119
تصویر شماره 3-27 شمای مراحل ساخت پلاسمید pBrsdds .....................................................120
تصویر شماره 3-28 نمای الکتروفورز ژل آگارز پلاسمید pTrsdds ............................................121
تصویر شماره 3-29 نمای الکتروفورز ژل آگارز ژن rsdds جدا شده از پلاسمید pTrsdds ...............122
تصویر شماره 3-30 نمای الکتروفورز ژل آگارز ژن rsdds خالص سازی شده ...............................122
تصویر شماره 3-31 نمای الکتروفورز ژل آگارز پلاسمید pBBR1MCS2 ...................................123
تصویر شماره 3-32 نمای الکتروفورز ژل آگارز پلاسمید خطی شده pBBR1MCS2 ......................124
تصویر شماره 3-33 نمای الکتروفورز ژل آگارز پلاسمید خطی شده pBBR1MCS2 خالص سازی شده.........124
تصویر شماره 3-34 شمای پلاسمید pBrsdds .........................................................................125
تصویر شماره 3-35 نمای الکتروفورز ژل آگارز کنترل پلاسمید pBrsdds ......................................125
تصویر شماره 3-36 توالی ژن atdds ..................................................................................126
تصویر شماره 3-37 شمای پلاسمید pBatdds ........................................................................127
تصویر شماره 3-38 شمای مراحل ساخت سلولهای نوترکیب .........................................................128
تصویر شماره 3-39 پیک مربوط به کوآنزیم Q10 استاندارد شناسایی شده توسط دستگاه HPLC ..........135
تصویر شماره 3-40 پیک مربوط به کوآنزیم Q8 استاندارد شناسایی شده توسط دستگاه HPLC ...........136
تصویر شماره 3-41 پیک مربوط به کوآنزیم Q9 استاندارد شناسایی شده توسط دستگاه HPLC ...........136
تصویر شماره 3-42 پیک کوآنزیم Q شناسایی شده در نمونه مجهول توسط دستگاه HPLC..................137
تصویر شماره 3-43 پیک کوآنزیم Q شناسایی شده در نمونه مجهول توسط دستگاه HPLC..................147
فهرست جداول
فصل اول
جدول شماره 1-1 انواع ژنهای کد کننده مسیر بیوسنتز کوآنزیم Q در "اشرشیاکلی" و "ساکارومایس سرویزیه".....15
جدول شماره 1-2 انواع آنزیم های "پلی پرنیل دی فسفات سنتاز".....................................................16
فصل دوم
جدول شماره 2-1 نام ژنهای مورد استفاده به همراه ویژگی آنها ......................................................52
جدول شماره 2-2 نام پلاسمیدهای مورد استفاده...........................................................................52
جدول شماره 2-3 نام آنزیم های برش دهنده مورد استفاده..............................................................53
جدول شماره 2-4 آنتی بیوتیک های مورد استفاده.........................................................................63
جدول شماره 2-5 ویژگی کامل آنزیم های برش دهنده مورد استفاده..................................................83
جدول شماره 2-6 ویژگی کامل آنزیم DNA T4" لیگاز"..............................................................84
فصل سوم
جدول شماره 3-1 اسامی پلاسمیدهای نوترکیب ساخته شده.............................................................99
جدول شماره 3-2 اسامی سلولهای نوترکیب ساخته شده.....................................................127 و 128
جدول شماره 3-3 اندازه سطح زیر منحنی نمونه کوآنزیم Q10 استاندارد در غلظتهای مختلف..............134
جدول شماره 3-4 غلظت کوآنزیم Q10 محاسبه شده در سلولهای نوترکیب ...........................137و 138
جدول شماره 3-5 وزن خشک سلولی محاسبه شده سلولهای نوترکیب.....................................139 و 140
جدول شماره 3-6 مقدار تولید کوآنزیم Q10 در سلولهای نوترکیب.................................................141
فهرست نمودارها
فصل سوم
نمودار شماره 3-1 منحنی استاندارد کوآنزیم Q10 ....................................................................135
نمودار شماره 3-2 منحنی استاندارد وزن خشک سلولی................................................................139
نمودار شماره 3-3 اثر ژن crtE ( بر روی وکتور pBAD24 ) در تولید کوآنزیم Q10 .....................142
نمودار شماره 3-4 اثر ژن crtE ( بر روی وکتور pTrc99A) در تولید کوآنزیم Q10 .....................143
نمودار شماره 3-5 اثر ژنهای مسیر بیوسنتز لیکوپن در تولید کوآنزیم Q10 .....................................144
نمودار شماره 3-6 اثر ژن crtE و ژنهای مسیر بیوسنتز لیکوپن به هراه ژن atdds در تولید کوآنزیم Q10...145
نمودار شماره 3-7 اثر ژن crtE و ژنهای مسیر بیوسنتز لیکوپن به هراه ژن rsdds در تولید کوآنزیم Q10....145
فهرست معادلات
فصل اول
معادله 1-1 معادله انتقال الکترون از کوآنزیم Q10 به کمپلکس بعد از آن ..........................................28
فصل دوم
معادله 2-1 معادله محاسبه pH ..............................................................................................92
فصل سوم
معادله 3-1 معادله محاسبه غلظت کوآنزیم Q10 تولید شده در سلولهای نوترکیب...............................140
